熒光PCR試劑盒在現代分子生物學領域占據著關鍵地位，其以準確、靈敏且高效的特性，為基因檢測、病原體鑒定、遺傳分析等諸多研究與應用提供了強有力的技術支撐。深入探究其基本工作原理與顯著優點，有助于我們更好地理解并運用這一強大工具。熒光PCR技術是在常規PCR基礎上，通過引入熒光標記的探針或染料，實現對PCR擴增過程的實時監測。在反應體系中，除了常規的模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶以及dNTPs等成分外，還包含特定的熒光物質。
 

　　(一)熒光探針法
 

　　該方法利用特異性寡核苷酸探針，其兩端分別標記熒光基團和淬滅基團。在未進行PCR擴增時，探針保持完整，熒光基團靠近淬滅基團，后者通過熒光共振能量轉移(FRET)抑制熒光發射，此時檢測不到熒光信號。當PCR反應進行到退火步驟時，引物與模板結合并延伸，TaqDNA聚合酶的5'→3'外切酶活性會切斷探針，使得熒光基團與淬滅基團分離，熒光信號得以釋放并被檢測系統捕捉。隨著每個循環新鏈合成，更多探針被切斷，熒光強度逐漸增強，且該強度與擴增產物量呈正相關，借此可對目標DNA進行定量分析。
 

　　(二)SYBR Green I 染料法
 

　　SYBR Green I 是一種能特異性結合雙鏈 DNA 小溝的熒光染料。在 PCR 反應初期，由于沒有雙鏈 DNA 生成，SYBR Green I 以游離態存在，熒光信號微弱。隨著 PCR 循環的推進，模板 DNA 不斷擴增形成雙鏈，SYBR Green I 與之結合后，構象改變導致熒光大大增強。不過，這種染料也能與非特異性雙鏈 DNA 結合，所以在實驗中常需通過熔解曲線分析來區分特異性擴增產物與非特異性擴增或引物二聚體。熔解曲線是通過逐漸升高溫度使雙鏈 DNA 解鏈，同時監測熒光變化而繪制，特異性擴增產物的熔解溫度相對恒定，據此可驗證反應的特異性。

 

　　熒光pcr試劑盒的使用注意事項：
 

　　1.試劑方面
 

　　-嚴格按照說明書操作：使用試劑盒前仔細閱讀說明書，按說明書要求進行樣本采集、處理、儲存和運輸等操作，如血液樣本需用特定抗凝管采集，組織樣本要及時處理，所有樣本低溫儲存運輸防DNA降解。
 

　　-避免試劑污染與交叉污染：使用無菌技術和一次性移液器槍頭、吸頭，不同實驗試劑分開存放并標記清楚；定期對實驗室清潔消毒，減少環境中微生物污染；注意試劑的保存條件，一般需在-20℃以下保存，避免反復凍融影響試劑活性。
 

　　-試劑使用前處理：使用前將試劑混勻，確保性能穩定可靠，可定期對試劑進行質檢。
 

　　2.實驗操作方面
 

　　-防止樣本污染：實驗人員應戴一次性手套、帽子等，避免頭發、皮膚細胞等污染樣本；樣品處理時盡量使用較長吸頭取樣，防止移液器污染導致交叉污染；加樣后將熒光定量PCR管瞬時離心，不要在管上做標志，手勿碰管蓋采光部位。
 

　　-準確加樣與操作規范：移液器使用前確保量程合適并校準準確，加樣時保持垂直緩慢吸取液體避免氣泡和誤差；配制反應液時試劑置于冰上，避免強光照射，所有試劑加到管底，配制完畢后低速離心數秒；分樣前樣品瞬離，加樣時關閉生物安全柜照明，在冰盒上操作，盡量避免直射光源。
 

　　-嚴格控制反應條件：根據目標分子和試劑盒要求準確設置PCR反應的溫度、時間和循環次數等條件，以確保反應的特異性和效率。
 

　　3.實驗室環境與設備方面
 

　　-實驗室分區管理：實驗室應實行嚴格的分區管理制度，如試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產物分析區等明確區分，各區域設備、物品不混用，工作人員離開各區域時不得將工作服帶出，清潔按特定方向進行，不同區域有各自清潔用具防止交叉污染。
 

　　-設備維護與校準：定期對熒光定量PCR儀進行清潔、消毒、校準和檢修，確保其性能穩定可靠，保證熒光信號檢測的準確性；儀器使用時注意安全操作，避免意外事故。