常遇到菌落PCR試劑盒問題疑難解答
瀏覽次數：969發布日期：2021-03-19
菌落
PCR試劑盒是篩選重組子的有效方法，可以使質粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時。但由于它直接以E.coli菌落為PCR而菌落中常常含有未進入細菌的、來源于連接反應的載體DNA和插入片段，所以十分容易產生假陽性。
菌落PCR試劑盒常遇到的疑難解答：
Q：樣品沒有擴增產物而陽性對照有產物出現。
A：可能是樣品DNA溶液中含有的細胞裂解物抑制了PCR擴增。建議將樣品DNA溶液用水稀釋5-100倍后再擴增（兩個梯度）。
Q：樣品和陽性對照都沒有擴增產物出現。
A：重新設計PCR反應參數或引物。
Q：陽性對照有大小不同的兩條擴增產物出現。
A：如果用戶自備的引物一條識別載體，一條識別插入片段，模板又是連接反應液，則出現此情況屬于正常，因為兩種插入方向的DNA在連接反應液里面都存在。
Q：菌落PCR試劑盒陰性對照有擴增產物出現。
A：如果是引物二聚體，實驗結果有效。如果片段跟陽性對照一樣，可能有污染，其他陽性結果也可能是污染引起，建議找到污染原因后再繼續實驗。
Q：一個普通菌落中一般有多少殘留的未轉化的DNA？
A：如果使用100ng的插入片段進行連接反應，用1/10的連接反應液進行轉化，再用1/10的轉化菌液涂盤，有一半插入片段進入細菌計算，則有0.5ng的插入DNA片段游離在細胞外，分布培養皿表面。一個培養皿的表面積一般為55cm2，一個直徑為5mm的菌落（面積約0.2mm2）則平均可能含有3pg左右的游離狀的插入DNA片段，如果使用插入片段專一性的PCR引物，則足夠在PCR反應中產生假陽性。
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